DNA Extraktion aus Blättern

Mai 2017

Die Isolation von genomischer DNA (gDNA), chloroplasten DNA (cpDNA) oder auch mitochondrialer DNA (mt) aus Pflanzen ist nicht ganz so einfach. Pflanzen produzieren eine unüberschaubare Menge an sekundären Inhaltsstoffen wie Glykoside, Polyphenole, Xanthone, Phenylpropanoide, Terpene, Steroide, Carotinoide, Speicherlipide und Alkaloide. Diese können die DNA zerstören oder auch eine nachfolgende PCR behindern.

In meinem Labor benutze ich grundsätzlich keine giftigen Chemikalien wie Phenol, Mecaptoethanol oder Chloroform, die man normaler Weise zum Aufreinigen von DNA verwendet. Deshalb habe ich ein Protokoll entwickelt, das für das Alpenveilchen funktioniert und genug saubere DNA für eine PCR abwirft. Ich habe ziemlich viel Zeit in dieses Protokoll investiert und will es hier gerne mit interessierten Pflanzengenetikern teilen:

Extraktion von DNA aus Blättern von Cyclamen ohne Phenol

Ausgangsmaterial ist ein kleines Stück von einem jungen Blatt ohne Adern. Es sollten nicht mehr als 50 mg sein. Dieses Blatt wird zerkleinert. Man kann dazu einen herkömmlichen Mörser nehmen und mörsert am besten mit flüssigem Stickstoff. Wenn dies nicht vorhanden ist, geht auch solch ein blauer Plastikmöppel ohne Stickstoff. Nur sollte man sich dabei beeilen und möglichst im Puffer zerkleinern. Der blaue Plastikmöppel heißt „Micro Pestel“.

Je Eppi nehme ich 800 µl HS Buffer, plus 100 µl SDS (10%), plus 20 µl DTT, plus 40  µl Proteinase K und plus 20 µl RNAse.

HS Buffer

10 mM TrisHCl pH 7.6
10 mM KCl
10 mM MgCl2
400 mM NaCL
2 mM EDTA

Proteinase K

20 mg/ml in 100mM Tris ph 8,6,, 6mM CaCl2, 50% Glycerin. Lagern bei -20°C

DTT

5 g DTT in 32,4 ml H2O oder 1M. Bei  20°C lagern.

Das ganze wird vorsichtig gemischt und kommt bei  65°C für zwei Stunden in den Heizblock. Kein Vortex! Das Eppi nur kurz invertieren, nicht zu doll mixen, da die DNA leicht schert. Ab- und an das Eppi bisschen bewegen.

Dann kommt das Eppi für 3 Minuten in die Zentrifuge mit Vollspeed. 700 µl vom Überstand kommen  mit 600 µl Isopropanol in ein neues Eppi und werden vorsichtig gemischt. Das alles bei Raumtemperatur! Dann wird die DNA 5 Minuten bei 12 K rpm abzentrifugiert. Nicht zu lange oder zu kalt, sonst kommt unerwünschtes Irgendwas mit.

Danach kann man das Pellet 2 x mit 70% EtOH waschen, trocknen und eine PCR versuchen. Mit viel Glück ist es schon sauber genug.

Für genomische DNA nehme ich das Pellet in Lysis Buffer auf und befolge das Protokoll von Roth. Gerade wenn man die DNA länger lagen will, empfiehlt sich eine bessere Aufreinigung. Hier wurde das Roti-Prep Genomic Kit von Roth benutzt, damit die DNA auch über Säulchen aufgereinigt ist. Aber Vorsicht, wenn man Chloroplasten oder Mitochondien DNA will, diese nicht mit Säulchen für gDNA aufreinigen.

Wichtig ist ein guter RNA Verdau. RNA kann auch die PCR stören.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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