Author Archives: hannah

Riemenschnecke

Riemenschnecke, Helicodonta obvoluta, Helix obvoluta

Kleine Glanzschnecke / Aegopinella pura

Die Kleine Glanzschnecke kommt im Hochsommer zu hunderten auf die reifen Johannisbeeren in meinem Garten. Die winzige Schnecke ist allerhöchstens 5 mm groß.

Die Fortpflanzung sei im Frühjahr, erwachsene Tiere sterben nach Eiablage, Jungtiere werden nach 2 Jahren geschlechtsreif (Schwer 1994). Warum also die Tiere im Hochsommer auf die Johannisbeeren steigen bleibt deren Rätsel. Vielleicht werden die Eier im Frühjahr an die Pflanzen gelegt und die Jungtiere steigen dann auf, um im Herbst mit den Blättern auf dem Boden zu überwintern.

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Schwarzer Schnegel/ Limax cinereoiger

Der sehr große Schnegel kann auch in grau oder weißlich vorkommen. Die Tiere haben eine dreigeteilte Sohle, deren äußere Felder dunkler sind. L. Cinereoiger ist die größte einheimische Nacktschnecke und kann bis 30 cm lang werden.

Dieser hier war an der Donauversickerung bei Geisingen.

Limax cinereoiger

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Posthornschnecke / Planorbarius corneus

Die Posthornschnecke ist eine Wasserlungenschnecke.

Planorbarius corneus erreicht mit den 4 bis 5 Windungen bis zu 4 cm.

Die Atmung erfolgt hauptsächlich über die Haut, daher kommen Posthornschnecken bei ausreichend sauerstoffhaltigem Wasser seltener als andere Wasserschnecken an die Oberfläche, um Luft zu holen. Am Kopf kann man die beiden nicht einziehbaren Fühler sehen, wobei sich die Augen an deren Basis befinden. Zusätzlich besitzen sie auch deutlich ausgeprägte Lippen.*


Posthornschnecke beim Mühlebach in Hüfingen

Sollte ein Austausch der Atemluft notwendig werden, so lassen sich die Tiere von der höchsten Blattspitze an einem Schleimfaden zur Wasseroberfläche treiben. Nach erfolgter Atmung wird derselbe Schleimfaden für den Rückweg benützt, auch andere Artgenossen verwenden diesen Weg zur Wasseroberfläche.*

Posthornschnecke beim Mühlebach in Hüfingen

Der Körper dieser Schnecke ist fast schwarz, sie ist jedoch die einzige europäische Vertreterin, deren Blut durch Hämoglobin rot gefärbt ist. Gelegentlich kommen unpigmentierte Exemplare vor, dann erscheint der Körper durch das Hämoglobin leuchtend rot. Durch diese Besonderheit kann die Posthornschnecke auch in sehr sauerstoffarmen Gewässern überleben.*

Posthornschnecke beim Mühlebach in Hüfingen

Nach: https://www.donauauen.at/wissen/natur-wissenschaft/fauna/posthornschnecke-planorbarius-corneus

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Extraktion von DNA aus Schnecken

30.07.2020

Malakazoologen sind diejenigen, die Schnecken bestimmen und untersuchen. Leider sind diese Zoologen bis heute eher Schnecken Leichenfledderer und “Häuslesammler”. Jetzt wollte ich aber unsere einheimischen Schnecken bestimmen und fotografieren, ohne diese irgendwie zu stören.
So kam mir die Idee, nach meinen umfassenden Untersuchungen mit dem Alpenveilchen, bei den Schnecken ebenso mit der DNA zu arbeiten.

Durch Recherche fand ich, dass es eine umfassende Datenbank auf NCBI gibt über 16S als Marker für verschiedene Schnecken (1).

In meinem Labor benutze ich grundsätzlich keine giftigen Chemikalien wie Phenol, Mecaptoethanol oder Chloroform, die man normaler Weise zum Aufreinigen von DNA verwendet. Deshalb habe ich ein Protokoll entwickelt, das für Schnecken funktioniert ohne diese auf irgend eine Weise zu verletzten oder diese Chemikalien zu verwenden.

Dann haben Schnecken viele Polysaccharide, sogenannte Mucopolysaccharide und auch Glycogen. Diese können die PCR stören oder auch die DNA zum scheren bringen. Wenn die DNA geschert ist, erkennt man dies an “Wölkchen” als PCR Produkt. Falls kein PCR Produkt erscheint, ist es auch möglich, dass die DNA nicht in Lösung ging und noch im Eppi klebt.

Ich habe ziemlich viel Zeit in dieses Protokoll investiert und will es hier gerne mit interessierten Menschen teilen.

Extraktion von DNA aus Schnecken ohne Phenol und ohne Chloroform

Schnecke auf Swab

Ausgangsmaterial ist ein Abstrich mit einem Wattestab (Swab).

Hierbei wird sich die Schnecke zurück ziehen, das macht aber nichts.

Dann kommt der Kopf vom Swab in ein Eppi. Ich schneide oft nur den Teil der Watte ab der mit der Schnecke in Berührung kam. Hier ist aber äußerste Vorsicht geboten, da eine Kontamination mit menschlicher DNA durchaus möglich ist.

Je Eppi nehme ich 800 µl WB Buffer, plus 20 µl DTT, plus 20 µl Proteinase K. Der Puffer mit der Watte kann hier bei -20° Grad weggefroren werden für eine spätere Extraktion.

WB Buffer

100 mM TrisHCl pH 7.6
5 mM EDTA
350 mM Sorbitol
1 % PVP 40
2 % CTAB
2 M Na Cl

Dieser Schritt ist für viele Schneckenarten essentiell!

Das Sorbitol verbindet sich mit den Mucopolysacchariden und das PVP Polyvinylpyrrolidone (molweight 40000) entfernt die Polyphenole.

Dies alles wird gut gemischt. Wenn das Eppi mit dem Puffer und der DNA erst aufgetaut werden soll, dann stelle ich dies kurz auf den Heizblock bei 60°C. Dann kommt der Waschschritt:

Das Eppi kommt bei 8000 rpm für 10 Minuten in die Zentrifuge.

Danach schwimmt wohl das Sorbitol mit den Mucopolysacchariden und das PVP mit den Polyphenolen oben und die DNA mit CTAB befindet sich unten.

Also pipettiert man diese oben weg. Dies mache ich nach Gefühl, so etwa die oberen 500 µl der Lösung kommen weg.

Auf die Watte und den unteren Teil kommt dann 800 µl EB, plus 50 µl SDS (10 %) plus 20 µl DTT, plus 20 µl Proteinase K.

EB Buffer

10 mM TrisHCl pH 7.6
10 mM KCl
10 mM MgCl2
400 mM NaCL
2 mM EDTA
1 % CTAB
1 % PVP40

CTAB Puffer löst man am besten über Nacht und nicht zu stark schütteln, schäumt! Das SDS im EB Puffer trübt den Puffer ein, ist aber kein Problem, im Heizblock wird der Puffer wieder klar.

Proteinase K

20 mg/ml in 100mM Tris pH 8,6, 6 mM CaCl2, 50% Glycerin. Lagern bei -20°C.

Proteinase K ist am meisten aktiv bei 65°C mit SDS und sollte mindestens 1x im Jahr neu angesetzt und alliquotiert werden.

DTT

1 g DTT in 6,5 ml H2O oder 1M. Aliquotieren und bei  -20°C lagern. DTT oxidiert schnell, deshalb lieber öfters neu machen. DTT ist ein Reduktionsmittel für Disulfidbindungen

Das Eppi mit EB, SDS, DTT, und Proteinase K wird vorsichtig gemischt und kommt bei 60°- 65°C für vier Stunden in den Heizblock. Ab- und an das Eppi bisschen bewegen und mischen, aber nicht zu doll, sonst kann die DNA scheren. Ich hatte es auch schon deutlich länger auf dem Heizblock und danach bei Raumtemperatur (2 Tage), ohne nennenswerte Verluste.

Nach dem Verdau werden 700 µl abpittetiert – diesmal möglichst von unten. Dies kommt mit 600 µl Isopropanol in ein neues Eppi und wird vorsichtig gemischt. Das alles bei Raumtemperatur! Dann wird die DNA 60 Sekunden bei 10 K rpm abzentrifugiert (gerne auch mehr, kann ich aber nicht). Nicht zu lange oder zu kalt, sonst kommt unerwünschtes irgendwas mit oder das Pellet lässt sich nur schwer wieder lösen.

Danach kann man das Pellet mit 70% kaltem EtOH waschen und trocknen. Ich trockne immer ein paar Stunden auf der Bench. Lösen tu ich es mit etwa 50 µl Bidest meist über Nacht auch auf der Bench.

Es ist wichtig eventuelle Reste der Proteinase K zu deaktivieren, da sonst die Taq verdaut wird! Deshalb erhitze ich hier die DNA nochmal etwa 10 Minuten bei 80 °C.

Falls die PCR später nicht funktioniert, kann das am ehesten an der DNA liegen. Natürlich nur, wenn man sich mit den Primern sicher ist. Hier empfiehlt sich eine positiv Kontrolle. Probleme mit der DNA kann z.B. von der Proteinase K kommen. Meiner Erfahrung nach kann man da mit der Konzentration und der Verdauzeit eher hoch gehen, als runter.  RNAse benutze ich meistens keine.

Dann wieder die Mucopolysaccharide, Polyphenole und auch Glycogen. Diese können die PCR stören oder auch die DNA zum scheren bringen. Wenn die DNA geschert ist, erkennt man dies an “Wölkchen” als PCR Produkt. Hier muss man nochmal alles neu machen. Vielleicht einen 2. Schritt mit dem WB einfügen. Falls kein PCR Produkt erscheint, ist es auch möglich, dass die DNA nicht in Lösung ging und noch im Eppi klebt.

1 lane 16 S PCR Produkt lane 2-4 “Wölkchen” mit gescherter DNA


PCR der 16S mitochondrialen rDNA von Schnecken

Die Primer sind alt bekannt und wurden 1991 von Palumbi veröffentlicht (2). Ich habe sie allerdings etwas modifiziert:

HM106f – CGGCCGCCTGTTTATCAAAAACAT
HM107r – GGAGCTCCGGTTTGAACTCAGATC

16S Produkt ist etwa 400 bp groß

PCR: 30 cycles mit annealing 56°C und Phusion Taq (NEB)

Die Bande wird ausgeschnitten, mit dem Monarch DNA kit von New England Labs aufgereinigt, bei GATC in Köln mit Primer HM103 sequenziert und die Sequenz mit NCBI Blast abgeglichen.

Hier das Ergebnis mit meinem ersten Versuch, der oben abgebildeten Posthornschnecke.


(1) Razkin et al., Molecular phylogeny of the western Palaearctic Helicoidea (Gastropoda, Stylommatophora). Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 83, Pages 99-117 (2015)

(2) Palumbi, S.R., Martin, A., Romano, S., McMillan, W.O., Stice, L., Grabowski, G., The Simple Fool’s Guide to PCR, Version 2.0. Department of Zoology, University of Hawaii, Honolulu, HI. (1991)

(3) Jean-René Arseneau, Royce Steeves, Mark Laflamme, Modified low-salt CTAB extraction of high-quality DNA from contaminant-rich tissues. Mol Ecol Resour (2017) DOI: 10.1111/1755-0998.12616

(4) Peter W. Inglis, Marilia de Castro R. Pappas, Lucileide V. Resende, Dario Grattapaglia, Fast and inexpensive protocols for consistent extraction of high quality DNA and RNA from challenging plant and fungal samples for high-throughput SNP genotyping and sequencing applications, PLOS one (2018) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206085

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Baumschnecke

Arianta arbustorum

Die Baumschnecke hieß früher Helix rufescens (Lais 1925) und wird auch Gefleckte Schnirkelschnecke oder Baumschnirkelschnecke genannt und ist noch relativ häufig.

Ähnlich wie auch die Bänderschnecken soll Arianta arbustorum durch Drosseln verbreitet werden.

Unsere hier war auf dem Weg neben dem Römerbad in Hüfingen zu finden.



Wie die 16S rDNA sequenziert wurde bitte hier schauen.

Arianta arbustorum|26|42AF40
TAAGTTGACTTATAATTGAAGTCTAGAATGAATGAATATACGGGCAGCAACTGTCTCAAAAGTATTTTTGCTAATTTAGTTACCAAGTGCAAATACTTGAAGTTATAAAAAAGACGAGAAGACCCTAGAAACTTAATTAATTTTGTTGGGGCGACAGAATTACAATATAAACTAATTTTCTATTACAGGAAACGTAGGTGAAAGAGCAAGTTACTCTAGGGATAACAGCGTAATTTAATTTAAGTTTGCGACCTCGATGTTGGACTAGGTATAGTAGTTTTTA









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Märzenschnecke

01.05.2020

Zebrina detrita

Die Märzenschnecke wird auch als Weiße Turmschnecke, Zebraschnecke oder Kaiserstuhlschnecke bezeichnet und gehört zur Familie der Vielfraßschnecken.

Die Märzenschnecke bevorzugt sonnige und trockene Standorte wie Magerrasen und Weinberge. Deshalb wurde sie im Kaiserstuhl von den Winzern nahezu ausgerottet.

Die Märzenschnecke wird in Deutschland als stark gefährdet angesehen und steht auf der Roten Liste Kategorie 2.

Unsere Märzenschnecke hier lebt auf dem Magerrasen am Hang vom Fürstenberg.

Wie die 16S rDNA sequenziert wurde bitte hier schauen.

Zebrina detrita|24|42AF37
GTGCTATCCTGCCCGGTGATTTTGTTTAACGGCCGCAGTACTTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCACTTGTCTTTTAAATGGGGACTGGAATGAAAGGATGTTTGGATTGAGGCTGTCTTCATACTACTTATATTAAATTGCTAAAGGGGTGAAAATTCCCCTAATGGAACATTAGACGAGAAGACCCTTAGAATTATTACAAAAATAGTGTTAACTATGAAGTGTTTGTTGGGGCAACAGGGTATTTATATAACATACTTATATATATATGTAAACAAGCAGATAATTTTATGCATGAATAATTACCTGAGGGATAACAGCATAATTTACTATAAGATTGTGACCTCGATGTTGGACTAAGGAGTTAACTTATTAGACGTAAGTTAAGATGGTTCTGTTCGAACCCTGTACCTTACATGATCTGAGTTCAGACCGG





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Sumpfschnecke

22.04.2020

Stagnicola palustris

Die Sumpfschnecke lebt überall in Europa in stehenden Gewässern und Flußauen mit reicher Vegetation. Sie bevorzugt einen pH-Wert um 7, mag Sümpfe und flache Abflüsse, verträgt aber auch periodisch austrocknende Gewässer.

Die hier sequenzierten und beschriebenen Sumpfschnecken sind von der Höhlensteinwiese, eine Überschwemmungswiese der Breg bei Hüfingen.

Die DNA der Sumpfschnecke ließ sich lange nicht sequenzieren. So habe ich oft einen Nematoden namens Nais communis gefunden. Es ist bekannt, dass Schnecken von viele Nematoden befallen sind. Ob diese in Symbiose oder als Schmarotzer in den Schnecken leben ist nicht bekannt. Ich behaupte hier mal dreist, dass Nais communis mit Stagnicola palustris friedlich in Symbiose lebt.

Wie die 16S rDNA sequenziert wurde bitte hier schauen.

Stagnicola palustris|21|42AF34
TAGCAGGCCGCAGTACCTTGGACTGTGCGTAAGGTAGCATAATCAATTGGCTTTTAATTGAAGTCTGGAATGAAAGGGATAATAGGAAAAAACTGTCTCAGAAAAAACTATTTGAAATTATTTAGTAAGTGAAAATACTTATATTCAGAAAAAAGACGAGAAGACCCTTAGAATTTTTATTAATAGATTCAATTTATATAAATTTTATATTTTAGTTGGGGCGACTTTGAACCATTTAAACGTTTATTAAAATACTCAACATTAAGATTTAAAAGAGCAAATTAGCTTAGGGATAACAGCATAATTTTTTATAAAGTTTGTGACCTCGATGTTGGACTAGGAACTTAATGATTAACCGTCAATATAGATTGTTCTGTTCGAACAGAAACTCCTACATGATC



Ein Stück weiter am Mühlebach in Hüfingen im Gewässer eines Spielplatzes gibt es auch noch Sumpfschnecken:

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