Dieser Artikel geht nur um einen H. influenzae Abstrich (Haemophilus influenzae strain hmjh) der 2022 in Leipzig isoliert wurde. Wer genauerer Informationen sucht sei auf die Seiten des Robert Koch Institutes verwiesen:
H. influenzae infiziert ausschließlich Menschen und braucht Hemin und NAD im Medium! Deshalb habe ich Mueller Hinton Agar mit diesen zwei Faktoren hergestellt:
Eine frische Hemin-Stammlösung wird hergestellt, indem man 50 mg Hemin-Pulver in 100 ml (0,01 mol/L NaOH) unter Erhitzen und Rühren aufgelöst werden, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist.
Eine Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD)-Stammlösung wird durch Auflösen von 50 mg NAD in 10 ml destilliertem Wasser hergestellt; nicht erhitzen, sondern sterilfiltrieren!.
Mueller-Hinton-Agar (MHA) aus einer handelsüblichen dehydrierten Basis nach den Anweisungen des Herstellers herstellen, plus 5 g Hefeextrakt und 30 ml Hemin-Stammlösung auf 1 Liter MHA.
Nach dem Autoklavieren und abkühlen 3 ml der NAD-Stammlösung dazu sterilfiltrieren.
H. influenza auf MHA plus Hefe, Hemin und NAD.
Sorry ist ne alte Platte, hatte gerade nichts besseres. H. influenza wächst relativ langsam also bei Neuanimpfung sollte man ihm schon zwei/drei Tage Zeit lassen.
Dieser H. influenza wurde bestimmt, indem seine 16S ribosomal RNA sequenziert wurde. Hierfür wurden vier Primer nach (1) gekauft.
PCR wurde mit Primern HM108 und HM109 bei 52°C mit Phusion Taq (NEB) gemacht.
Das 16S PCR Produkt von H. influenza hat etwa 1550 bp.
Dieses PCR Produkt wurde ausgeschnitten und mit dem Monarch Gel Extraction Kit von NEB aufgereinigt und mit allen vier Primern (HM108, HM109, HM110, HM111) sequenziert. Die Sequenz wurde zusammengefügt:
NCBI-Blast mit dem sequenzierten Serotyp ergibt Übereinstimmung mit M10523 aus (1) 67P38H1 und 67P56H1 aus (2).
Einordnung des Serotyps unsere Isolates hmjh aus (2)
Weiter wurde versucht den Serotyp zu bestimmen. Zuerst wurden hierfür Primer nach (3) bestellt. Leider scheint unser Isolat keiner der typisierten Serotypen zu sein. Es wurde mit Wobble Primer ein Fragement des Isolates amplifiziert und sequenziert:
Leider darf ich bei NCBI nichts mehr hochladen, da ich zu keiner Uni gehöre. Deshalb muss man hiermit vorlieb nehmen.
(1) High Level of Sequence Diversity in the 16S rRNA Genes of Haemophilus influenzae Isolates Is Useful for Molecular Subtyping, Claudio T. Sacchi et.al., Journal of Clinical Microbiology, p. 3734–3742, Aug. (2005)
(2) Haemophilus influenzae genome evolution during persistence in the human airways in chronic obstructive pulmonary disease, Melinda M. Pettigrew, PNAS, https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5889651/pdf/pnas.201719654, (2018)
(3) PCR for capsular typing of Haemophilus influenzae, T J Falla 1, D W Crook, L N Brophy, D Maskell, J S Kroll, E R Moxon, Journal of Clinical Microbiology, 1994 Oct;32(10):2382-6. doi: 10.1128/jcm.32.10.2382-2386.1994. (1994)
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