Alpenveilchen 1. – 4. Teil

Mai 2017

Cyclamen purpurascens – eine molekulargenetische Analyse

Im April 2017 habe ich einen kleinen Bericht in den Schriften der Baar zu Alpenveilchen veröffentlicht. Ab Seite 123: Schriften der Baar 2017 

In der Literatur werden etwa 20 Arten verschiedene Cyclamen (Alpenveilchen) unterschieden. Das Europäische Alpenveilchen (Cyclamen purpurascens) ist aber die einzige in Deutschland heimische Cyclamen Art. In der Arbeit wollten wir ein Alpenveilchenvorkommen im Brigachtal genauer bestimmen. 

Hierfür untersuchte ich verschiedene Fragment der Chloroplasten-DNA und auch der genomischen DNA von dem wilden Alpenveilchen und als Kontrolle ein Alpenveilchen aus einer Gärtnerei.

Die Isolation von genomischer DNA aus Pflanzen ist nicht ganz so einfach. In meinem Labor benutze ich grundsätzlich keine giftigen Chemikalien wie Phenol, Mecaptoethanol oder Chloroform. Deshalb habe ich ein Protokoll entwickelt, das für das Alpenveilchen funktioniert und genug saubere DNA für eine PCR abwirft. Ich habe ziemlich viel Zeit in dieses Protokoll investiert und will es hier gerne mit interessierten Pflanzengenetikern teilen:

Extraktion von DNA aus Blättern von Cyclamen ohne Phenol

Ergebnisse 1. Teil

Die untersuchten Abschnitte aus dem Chloroplasen zeigten eindeutig, dass es sich bei den Pflanzen im Brigachtal um Cylamen purpurascens handelt. Hier will ich die Ergebnisse der Sequenzierung mit der ribosomalen DNA zeigen, die aus dem Zellkern stammt. Die flankierenden Spacer um die 5.8S ribosomale DNA sind am besten untersucht bei den verschiedenen Cyclamen Arten und zeigen auch am meisten Unterschiede.

Phylogenetischer Baum der verschiedenen Alpenveilchenarten anhand des Fragments um die 5.8S ribosomale DNA.

Anhand von vier DNA-Fragmente wurde nachgewiesen, dass es sich bei den Alpenveilchenvorkommen im Brigachtal um das Europäische Alpenveilchen (Cylamen purpurascens) handelt. Es ist mit Sicherheit keine Zuchtform. Das Alpenveilchen aus der Gärtnerei hingegen wurde aus Cylamen hederifolium gezüchtet.

Ausblick

Im Jahr 2012 kam eine sehr interessante Veröffentlichung von Slovak et al. heraus, bei der ein bestimmtes Fragment der Chloroplasten DNA (trnD-trnY Intergenic spacer) sequenziert wurde (1).  Hierfür wurden 82 verschiedene Cylamen purpurascens aus verschiedenen Regionen Europas ausgewählt und verglichen. Leider war die ganze Arbeit vergebens, da in dem Fragment trnD-trnY nur vier verschiedene Basen an den unterschiedlichen Standorten existieren. Aus diesen vier Stellen des Fragments „trnD-trnY Intergenic spacer“ lassen sich entgegen der Aussage nach Slovak et al. keine Rückschlüsse auf den Standort des Europäischen Alpenveilchens ziehen.

Die geographische Kartierung des Europäischen Alpenveilchens (1) enthält leider nicht die versprochenen Unterschiede innerhalb der Sequenzen. So kamen wir auf die Idee, die Arbeit selber neu zu machen. Aber mit einem geeigneteren Abschnitt.

Da das Fragment um die 5.8S ribosomale DNA auch innerhalb vom Cylamen purpurascens Unterschiede aufweist, kam es uns am geeignetsten vor. Jetzt soll zuerst die gesamte rDNA mit externen und internen Spacern, sowie die Sequenz zwischen den Repeats, sequenziert werden. Diese Sequenz wird dann bei unterschiedlichen geographischen Standorten verglichen.

Die Fortschritte dieser Untersuchungen werde ich hier schildern:

Geographische Kartierung von Cylamen purpurascens anhand der genomischen Sequenz der ribosomalen DNA.

Hier gehts zu Teil 2

Juni 2017

Cyclamen purpurascens – eine molekulargenetische Analyse

Im April 2017 habe ich einen kleinen Bericht in den Schriften der Baar zu Alpenveilchen veröffentlicht, der aber erst ab März 2018 online gestellt wird. Ab Seite 123: Schriften der Baar 2017      Mehr auch hier

In der Literatur werden etwa 20 Arten verschiedene Cyclamen (Alpenveilchen) unterschieden. Das Europäische Alpenveilchen (Cyclamen purpurascens) ist aber die einzige in Deutschland heimische Cyclamen Art. Ein Vorkommen im Brigachtal und eines bei Tuttlingen soll molekurlargenetisch genauer bestimmt werden.

Hierfür untersuchte ich ein Fragment der genomischen DNA von den wilden Alpenveilchen und als Kontrolle zwei Alpenveilchen aus Gärtnereien.

Die Isolation von genomischer DNA aus Pflanzen ist nicht ganz so einfach. In meinem Labor benutze ich grundsätzlich keine giftigen Chemikalien wie Phenol, Mecaptoethanol oder Chloroform. Deshalb habe ich ein Protokoll entwickelt, das für das Alpenveilchen funktioniert und genug saubere DNA für eine PCR abwirft. Ich habe ziemlich viel Zeit in dieses Protokoll investiert und will es hier gerne mit interessierten Pflanzengenetikern teilen:

Extraktion von DNA aus Blättern von Cyclamen ohne Phenol

Ergebnisse 2. Teil

Hier will ich die Ergebnisse der Sequenzierung mit der ribosomalen DNA zeigen. Die flankierenden Spacer um die 5.8S ribosomale DNA sind am besten untersucht bei den verschiedenen Cyclamen Arten und zeigen auch am meisten Unterschiede.

Phylogenetischer Baum mit den Alpenveilchenvorkommen aus dem Brigachtal und Tuttlingen anhand der DNA um den Bereih 5.8S rDNA im Vergleich zu den Sequenzen aus der NCBI Datenbank.

Bei den Alpenveilchenvorkommen bei Tuttlingen und im Brigachtal handelt es sich um reines Cyclamen purpurascense und um keine Zuchtform. Als Vergleich wurden auch noch Pflanzen aus der Gegend um Grenoble und aus Kroatien untersucht. Bei allen Pflanzen handelt es sich um das Europäische Alpenveilchen.

Die Pflanzen aus der Gärtnerei waren u.a. mit Cyclamen hederifolium und Cyclamen africanum gezüchtet und auch winterhart.

Hier gehts zu Teil 3

Oktober 2017

Cyclamen purpurascens bei St-Vincent-de-Mercuze in Frankreich.

Ergebnisse 3. Teil

Hier will ich erste Ergebnisse der Sequenzierung mit der ribosomalen DNA zeigen. Die ribosomale DNA ist ein Repeat. Das heißt sie wiederholt sich. Da ich keinerlei Sequenzinformationen des Alpenveilchens habe, ist dies ein Vorteil für mich. Ich konnte meine ersten Primer so bestellen, dass sie mit der 26S von Arabidopsis übereinstimmen. Dies ist zwar nicht sehr passend, aber jetzt sind mir die etwa 4000 Basenpaare der DNA von Cyclamen purpurascens in diesem Bereich bekannt.

Gerade die Spacer zwischen den einzelnen Transkriptionseinheiten sind für die Unterscheidung sehr interessant. Veränderungen in der DNA an diesen Stellen (ETS, ITS1, ITS2) beeinflussen das Alpenveilchen nicht. So konnte ich bei Cyclamen purpuascens von verschiedenen Standorten auch Unterschiede finden.

 

rDNA-Repeat der ribosomalen Untereinheiten. Der external transcribed spacer (ETS) und die internal transcribed spacer (ITS1 + ITS2) befinden sich zwischen den Transkriptionseinheiten.

Wie im 2. Teil angemerkt, habe ich DNA von einer Pflanze aus der Gegend um Tuttlingen und einer Pflanze aus dem kroatischen Orljavac. Beide Standorte gelten als nicht natürliche Standorte vom Alpenveilchen. Sie wurden also vom Menschen ausgewildert. Genau wie die Spekulationen über das Vorkommen im Brigachtal sind.

Dann konnte ich noch Blattmaterial von einem natürlich Vorkommen von Cylamen purpurascens in der Gegend von St-Vincent-de-Mercuze in Frankreich bekommen. Es handelt sich hierbei um zwei Standorte etwa 3 km von einander entfernt.

Weiter durfte ich im Botanischen Garten der Universität Zürich mit Erlaubnis von Peter Enz (Gartenleiter) von sechs weiteren Pflanzen Blätter haben. Die Pflanzen, bzw. deren Nachkommen, stammen aus Aufsammlungen 1992 aus der Gegend um Schaffhausen und von 2009 aus dem Tessin.

Cyclamen purpurascens im Botanischen Garten der Universität Zürich.

Von der DNA dieser Pflanzen habe ich nun diese etwa 4000 Basen der ribosomalen DNA sequenziert und miteinander verglichen. Die Ergebnisse habe ich hier in einem phylogenetischen Baum dargestellt.

Phylogenetischer Baum der verschiedenen Alpenveilchen Vorkommen

Leider lassen sich die verschiedenen Standorte – Tessin oder Schaffhausen – nicht eindeutig zuordnen. Momentan erscheint es aber so, dass das Vorkommen aus Tuttlingen, sowie das Vorkommen aus Kroatien irgendwann aus dem Tessin entnommen wurde.

Vom Alpenveilchen im Brigachtal konnte bis jetzt kein entsprechendes natürliches Vorkommen gefunden werden.

Diese Daten sind noch lange nicht vollständig. Es müssen weiter Blätter von Cyclamen purpurascense gesammelt werden. Am besten von nachweislich natürlichen Standorten.

 

Cyclamen purpurascens bei Arcumeggia in der Nähe vom Lago Maggiore in Italien.

 

 

 

 

 

 

 

Dezember 2017

Ergebnisse 4. Teil

Die ribosomale DNA (rDNA) als geographischer Marker bei Cyclamen purpurascens hat sich inzwischen bewährt. Nochmal kurz zur rDNA:

Die rDNA kodiert die Gene für ribosomale RNA, also einen Großteil der Ribosomen. In eukaryotischen Zellen gibt es rDNA nicht nur im Zellkern, sondern auch in den Mitochondrien, und bei Pflanzen zusätzlich in den Plastiden. Dazu kommt, dass es ein Repeat ist, sich also ziemlich oft wiederholt. Dies alles verursacht bei der Sequenzierung Probleme, auf die ich hier nicht näher eingehen will.

Gerade die Spacer zwischen den einzelnen Transkriptionseinheiten sind für die Unterscheidung sehr interessant. Dies sind ETS, ITS1und ITS2

rDNA-Repeat der ribosomalen Untereinheiten. Der external transcribed spacer (ETS) und die internal transcribed spacer (ITS1 + ITS2) befinden sich zwischen den Transkriptionseinheiten.

Vor allem mit Hilfe des Forum Flora Austria konnte ich viele verschiedene Blätter von Cyclamen purpurascens aus Österreich bekommen und werde wohl auch noch viele bekommen. An dieser Stelle nochmals vielen Dank an alle Beteiligten! Ihr habt mich einen großen Schritt weiter gebracht.

Durch einen kleinen Urlaub in Italien habe ich jetzt 70 Blätter in meiner Sammlung und auch schon einen großen Teil davon sequenziert.

Untersuchte Blätter von Cyclamen purpurascense in rot.

Man kann zwei Sequenzfiles namens AB1 mit einem Programm namens SeqDoc vergleichen. Oben und unten sind die verschiedenen Sequenzen und in der Mitte die Gemeinsamkeiten (flacher Peak) und Unterschiede (großer Peak).

Ein  Unterschied zwischen den Pflanzen aus Österreich und der Schweiz liegt vorne auf dem ETS. So ist nach den GGG bei den Pflanzen aus der Schweiz und Italien nur ein C, bei den Österreichischen Pflanzen zwei CC vor den vier AAAA.  Hier die Peaks:

Vergleich von 50 Basen auf dem ETS zwischen einer Pflanze aus dem Tessin und einer aus Niederösterreich.

Ein anderer auffälliger Unterschied ist im ITS1. Hier ist ebenfalls bei den Österreichischen Pflanzen eine Base (G) mehr.

Chromatogramm mit zwei AB1 files von der Sequenzierung mit SeqDoc.

Am Anfang vom ETS kann man schon die verschiedenen Standorte unterscheiden. Die rDNA Sequenzen der verschiedenen Standorte wurde mit dem Programm Multi Sequence Alignment by CLUSTALW verglichen. Hier die Sequenz vom ETS vorne mit ausgewählten Pflanzen:

5′ Ende vom ETS mit 50 Basen von ausgewählten Standorten.

Mit dem dem Programm Multi Sequence Alignment by CLUSTALW kann man dann einen polygenetischen Baum mit den Sequenzen der rDNA erstellen.

Polygenetischer Baum der rDNA ausgewählter Standorte von Cyclamen purpurascens.

Kommen wir zu dem Rätsel, warum die Pflanzen aus dem Klostergarten Allerheiligen in Schaffhausen, die Pflanze aus Orljavac in Kroatien und die Tuttlinger Pflanze aus der Nähe vom Kraftstein die selbe Sequenz wie die Pflanzen aus Österreich haben.

Die Pflanze aus Kroatien stammt aus der Nähe der Benediktioner Abtei des heiligen Mihovil.

Benediktiner-Abtei des Heiligen Michael bei Orljavac.

Das Kloster Allerheiligen wurde ebenso von den Benediktinern gegründet und bei Tuttlingen befindet sich das Kloster Beuron mit der Erzabtei St. Martin.

Die Benediktiner legten schon früh Heilpflanzengärten an und brachten viele Pflanzen über die Alpen. Damals war es auch üblich, dass einmal im Jahr Bauern eingeladen wurden, um in den Gärten unterrichtet zu werden. Dieser Brauch war noch bis 1911 im Salzburgischen Kloster üblich. Salzburg war und ist mit der Erzabtei St. Peter ein Zentrum der Benediktiner. „Wolfgang Erdäpferl“ wurden Cylamen purpurascens von den Einheimischen genannt und  es wurde ihm eine besonders heilende Wirkung bei Schlangenbiß, Migräne, Kopfbeschwerden und als Zaubertrank nachgesagt. (Siehe Salzburgwiki). 

Von wo aus genau -Salzburg oder Wien- die Benediktiner das Alpenveilchen ursprünglich verteilt haben, lässt sich nicht genau sagen. Es gibt sowohl im Salzburger Land, als auch in Niederösterreich Cyclamen mit der selben Sequenz der rDNA. Allerdings sind die Pflanzen um Wien einheitlich und die Pflanzen um Salzburg weisen zum Teil Variationen auf. Es läßt sich also spekulieren, dass um Salzburg das „Erdapferl“, das im großen Stiel als Heil und Fruchtbarkeits-Symbol für Pilger gesammelt und verkauft wurde, dadurch vielleicht etwas selten wurde. Womöglich wurde um Salzburg denn wieder mit Pflanzen aus den Klostergärten „aufgeforstet“.

Klostergarten Allerheiligen in Schaffhausen.

Cyclamen purpurascens war für die Benediktiner eine wichtige Heilpflanze die in den Klostergärten zu finden war und ist. Allem Anschein nach wurde das Alpenveilchen von den Benediktinern aus Österreich über die Ränder der Alpen hin verteilt. Wenn die Bedingungen für die Pflanzen gut waren, kann man sie heute noch finden.

Allerdings stammt das Cyclamen purpurasecens im Brigachtal nicht aus Österreich.

Woher es stammt, wird die Zukunft zeigen. Es fehlen mir noch einige natürliche Standorte.

 

 

1) Slovak et al. Multiple glacial refugia and postglacial colonization routes inferred for a woodland geophyte, Cyclamen purpurascens: patterns concordant with the Pleistocene history of broadleaved and coniferous tree species. The Linnean Society of London 105 (2012):

 

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